Ауксилярные клетки

Экзосомы – межклеточная почта

Ауксилярные клетки
: 7 Окт 2017 , Россия Делает Сама , том 75, №4

Давно известно, что клетки «общаются» друг с другом посредством сигнальных молекул, которые они выделяют в межклеточную жидкость. Но открытия последних лет радикально изменили взгляды на механизмы этого взаимодействия.

Выяснилось, что, помимо сигнальных молекул, клетки секретируют везикулярные (пузырьковые) структуры, которые могут перемещаться по организму и избирательно проникать в другие клетки, доставляя в них белки и нуклеиновые кислоты и таким образом влияя на их жизнедеятельность

Нельзя сказать, что до открытия «путешествующих» пузырьков-везикул биологи совсем не подозревали о том, что клетки секретируют подобные структуры, как и о возможности межклеточного переноса нуклеиновых кислот.

Так, было известно, что при содержании в культуре клетки выделяют в среду ДНК и РНК, а в крови животных обнаруживали циркулирующие внеклеточные молекулы нуклеиновых кислот.

Однако секретируемым клетками везикулярным структурам приписывалась роль «мусорщиков», убирающих из клетки ненужные вещества, а появление в кровотоке нуклеиновых кислот зачастую объясняли их поступлением из погибших клеток. При этом не предпринималось никаких попыток установить, в составе каких структур секретируются из клеток эти макромолекулы.

Все изменилось в 2007 г., когда было обнаружено, что крошечные внеклеточные пузырьки, которые выделяют клетки, несут в себе функционально активные генетические программы (Valadi, 2007). Начались активные исследования структуры везикул, механизма их биогенеза и биологической активности.

Оказалось, что эти внеклеточные образования являются не «мусорщиками», а транспортерами биологических макромолекул, среди которых – ​короткие регуляторные РНК (микро- и другие некодирующие РНК) и даже кодирующие матричные РНК (мРНК).

С помощью мРНК эти «посланники» могут побуждать клетки-реципиенты синтезировать белки, которые до этого в них не присутствовали.

В исследования везикулярных структур включились ведущие биологические и биомедицинские лаборатории. В 2011 г.

в Гетеборге (Швеция) было основано Международное общество по внеклеточным везикулам, а уже на следующий год состоялась первая конференция, посвященная исключительно этой области исследований.

Тогда же был основан и журнал Journal of Extracellular Vesicles. С тех пор Общество проводит ежегодные симпозиумы, школы и конференции.

Какими они бывают

Внеклеточные везикулы представляют собой сферические структуры размером от 40 до нескольких сотен и даже тысяч нанометров. Их подразделяют на разные типы в зависимости от размеров, состава и способа образования.

Экзосомы обычно выделяют из биоматериала – ​культуральной среды (если речь идет о культурах клеток) или биологических жидкостей, таких как кровь, моча, слюна. Классический способ выделения путем последовательного центрифугирования – ​процесс длительный и трудоемкий. Для практического применения обычно используют гель-фильтрацию, которая позволяет разделять частицы на основании их размера. Этот способ обеспечивает получение достаточно чистых препаратов, однако также занимает много времени, что ограничивает его использование в широких масштабах. Для выделения фракций микровезикул, несущих определенные белки, используют аффинные методы выделения (с помощью антител к нужным белкам)

Самый большой (до 5000 нм) размер среди внеклеточных везикул имеют апоптотические тельца, которые представляют собой фрагменты клеток, разрушившихся в результате апоптоза – ​процесса запрограммированной клеточной гибели.

Ученые «доэкзосомной» эпохи часто предполагали именно этот вариант, когда находили в кровотоке нуклеиновые кислоты.

Микровезикулы, размер которых может достигать 1000 нм, образуются путем отпочковывания в окружающую среду участка плазматической мембраны клетки.

Но наибольшее внимание научного мира сейчас приковано к экзосомам. Эти везикулы, имеющие размер от 40 до 100—150 нм, образуются в эндосомах – ​мембранных внутриклеточных органеллах, связанных с транспортом вещества внутри клетки.

Экзосомы формируются путем «впячивания» участка эндосомальной мембраны в просвет органеллы, который затем отшнуровывается. Эндосома, содержащая экзосомы, называется уже мультивезикулярным тельцем.

Эта клеточная структура либо уничтожается протеолитическими ферментами, либо направляется к мембране клетки, где сливается с ней и «раскрывается», выбрасывая свое содержимое во внеклеточную среду.

Везикулярные структуры могут секретировать самые разные клетки. В зависимости от вида клеток и условий культивирования они несут разные наборы РНК и белков, а также могут содержать ДНК. Например, было показано, что экзосомы клеток разных видов рака могут переносить двуцепочечную ДНК, в которой присутствуют те же мутации, что и в ДНК родительской раковой клетки (Thakur et al., 2014).

«Длинные руки» клеток

Сегодня не вызывает сомнений, что экзосомы участвуют во многих процессах в организме. С ними, к примеру, связывают терапевтические эффекты стволовых клеток – ​недифференцированных («незрелых») клеток, из которых формируются специализированные клетки и ткани.

Стволовые клетки уже давно пытаются применять в медицине, и не без успеха.

Так, имеются положительные результаты экспериментов по восстановлению повреждений печени, почек, легких, кожи и даже сердечной мышцы после инфаркта с помощью инъекций стволовых клеток.

Есть предположение, что такое регенеративное действие оказывают не сами клетки, а секретируемые ими продукты, в том числе микровезикулы, которые переносят специфические наборы матричных и малых интерферирующих РНК (Rani, 2015).

Экзосомы, выделяемые антигенпрезентирующими дендритными клетками, играют важную роль в развитии иммунного ответа.

Эти клетки захватывают антигены – ​чужеродные молекулы и представляют их другим клеткам иммунной системы – ​T-лимфоцитам, участвующим в дальнейших иммунных реакциях организма.

Экзосомы, как и их клетки-прародительницы, также имеют встроенный в мембрану молекулярный главный комплекс гистосовместимости, в составе которого антигены «представляются» иммунным клеткам организма.

Экзосомы вовлекаются и в развитие вирусных инфекций. Так, клетки, зараженные ВИЧ, могут с помощью экзосом распространять по организму вирусные белки и РНК, таким образом способствуя ослаблению иммунной системы и развитию инфекции (Madison, 2015; Teou, 2016).

Много экзосом выделяют и клетки злокачественных опухолей. Дело в том, что наибольшее число экзосом продуцируется при пониженной концентрации кислорода (гипоксии), а такое состояние характерно для опухоли. Экзосомы содействуют развитию и распространению рака в организме, увеличивая проницаемость сосудов и подготавливая почву для успешного метастазирования.

Так, в случае глиобластомы, одной из самых распространенных и агрессивных опухолей мозга, экзосомы ускоряют рост раковых клеток и способны вызывать злокачественную трансформацию нормальных клеток.

Экзосомы заметно влияют на микроокружение опухолевых клеток, меняя состав поверхностных белков клеток нейроглии – ​вспомогательного «персонала» мозговой ткани и уровень секреции цитокинов (небольших гормоноподобных пептидных молекул), снижая тем самым способность макрофагов захватывать опасные объекты. В клетках микроглии (вспомогательных иммунных клетках центральной нервной системы) экзосомы провоцируют накопление белка матриксной металлопротеиназы, характерного для клеток опухоли и стимулирующего развитие метастазов и ангиогенез (разрастание сосудов) (Gourlay, 2016).

Одно из свойств глиобластомы, способствующих ее быстрому распространению, – ​образование инвадоподий. Эти выросты клеточной мембраны, богатые сократительным белком актином, могут разрушать внеклеточные тканевые структуры благодаря действию ферментов протеаз, расщепляющих белки. Оказалось, что рост и регуляция инвадоподий также могут быть опосредованы экзосомами (Hoshino, 2013).

Перспективы в диагностике и терапии

Исследования экзосом уже привели к получению практических результатов, и в первую очередь в диагностике: при ряде заболеваний из биологических жидкостей человека можно выделить экзосомы, несущие маркеры – ​определенные РНК и белки, которые можно проанализировать. Такие методы диагностики называют «жидкой биопсией», и они гораздо менее травматичны, чем обычная тканевая биопсия, и занимают меньше времени.

Именно на таком принципе работают диагностические наборы для обнаружения немелкоклеточного рака легкого и рака простаты производства компании Exosome Diagnostics (США).

С их помощью определяют наличие особых «раковых РНК» в экзосомах, выделенных из крови пациента, что дает возможность поставить диагноз на ранней стадии болезни.

Компания готовится представить подобные наборы для определения генетических мутаций при раке легкого, что важно для выбора стратегии лечения.

Можно простимулировать культивируемые клетки выделять много экзосом, например, создавая им стрессовые условия. Для этого можно уменьшить в среде концентрацию глюкозы, изменить кислотность, температуру или степень насыщения кислородом либо добавить определенные химические вещества.
В промышленном масштабе получать экзосомы пока не научились, но зато экзосомоподобные везикулы легко можно выделить из обычного молока. И такие структуры уже успешно опробованы в качестве переносчиков химиопрофилактических и химиотерапевтических препаратов. Также предпринимаются попытки разработать технологии создания искусственных экзосомоподобных везикул из клеточных мембран. Так, исследователи из Южной Кореи разработали технологию, позволяющую срезать с клеток фрагменты клеточной мембраны, которые потом сами собираются в везикулы диаметром 100—300 нм (Yoon, 2015)

Ведутся исследования возможностей диагностики заболеваний и на основе белковых маркеров экзосом. К примеру, уже описаны белковые «палитры» экзосом, характерные для разных типов рака молочной железы, что позволяет детально характеризовать заболевание и отслеживать эффективность его лечения.

Экзосомы перспективны и как универсальные инструменты для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов. За счет присутствия в мембране особых липидов и белков они могут специфично связываться только с определенными клетками.

Сами же экзосомы практически не иммуногенны, нетоксичны, устойчивы в биологических средах и хорошо защищают свое содержимое от разрушения.

А небольшой размер этих везикул позволяет им легко проникать в различные органы и ткани, минуя, в том числе, и гематоэнцефалический барьер, защищающий мозг.

С помощью экзосом можно доставлять в клетки не только химиопрепараты, но и терапевтические нуклеиновые кислоты.

Например, компания Codiak совместно с Онкологическим центром Андерсона при Техасском университете (США) разрабатывает на основе экзосом препарат для лечения рака поджелудочной железы.

Известно, что одна из причин возникновения этого типа рака – ​мутация в протоонкогене Kras, которая приводит к синтезу мутантной формы соответствующего фермента и злокачественной трансформации клетки.

Созданные исследователями экзосомы доставляют в раковые клетки малую молекулу РНК, специфичную к мутантному гену, что подавляет его работу по механизму РНК-интерференции. Это приводит к замедлению метастазирования и увеличивает выживаемость у лабораторных животных (Kamerkar, 2013).

Дальнейшие исследования в этой области могут привести к созданию эффективных лекарственных средств против разных видов рака.

Исследования в области экзосом сегодня находятся на переднем крае мировой науки.

Множество научных коллективов и организаций занимаются изучением их строения, биогенеза, возможностей для применения в качестве диагностических маркеров и терапевтических средств.

Такой работой занимаются и специалисты Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск): как приложениями экзосом в диагностике, так и их лекарственным «наполнением» для адресной доставки в клетки.

Несмотря на уже накопленную информацию, мы многое про экзосомы еще не знаем.

Например, известно, что одни и те же клетки могут секретировать экзосомы с совершенно разными наборами молекул, но вот как именно функциональное состояние клеток влияет на содержимое экзосом, остается загадкой.

Однако перспективы применения подобных структур в медицине очевидны, а дальнейшие фундаментальные исследования должны принести уже в ближайшее время много открытий.

Литература

Edgar J. R. Q&A: What are exosomes, exactly? // BMC Biology. 2016. V. 14. N. 1. P. 46.

Rani S., Ryan A. E., Griffin, M. D. et al. Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles: Toward Cell-free Therapeutic Applications // Molecular Therapy. 2015. V. 23. N. 5. P. 812—823.

Raposo G., Stoorvogel W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends // Journal of Cell Biology. 2013. V. 200. N. 4. P. 373—383.

Valadi H., Ekstrom K., Bossios A. et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells // Nature Cell Biology. 2007. V. 9. N. 6. P. 654—659.

: 7 Окт 2017 , Россия Делает Сама , том 75, №4

Источник: https://scfh.ru/papers/ekzosomy-mezhkletochnaya-pochta/

Бессмертные клетки HeLa • Библиотека

Ауксилярные клетки

В большую науку эти клетки попали совершенно неожиданно. Они были взяты у женщины по имени Генриетта Лакс (HEnrietta LAcks), которая вскоре после этого умерла. Но культура клеток убившей ее опухоли оказалась незаменимым инструментом для ученых.

В биомедицинских исследованиях и при разработке новых видов лечения часто используют выращенные в лаборатории культуры человеческих клеток. Среди множества клеточных линий одна из самых известных — HeLa.

Эти клетки, имитирующие организм человека in vitro («в пробирке»), «вечны» — они могут бесконечно делиться, результаты исследований с их использованием достоверно воспроизводятся в разных лабораториях.

На своей поверхности они несут достаточно универсальный набор рецепторов, что позволяет использовать их для исследования действия различных веществ, от простых неорганических до белков и нуклеиновых кислот; они неприхотливы в культивировании и хорошо переносят заморозку и консервацию.

Генриетта Лакс

Генриетта Лакс была красивой чернокожей американкой. Она жила в небольшом городке Тернер в Южной Виргинии вместе с мужем и пятью детьми.

1 февраля 1951 года Генриетта обратилась в госпиталь Джонса Хопкинса — ее беспокоили странные выделения, которые она периодически обнаруживала на своем нижнем белье. Медицинский диагноз был страшен и беспощаден — рак шейки матки.

Восемь месяцев спустя, несмотря на хирургию и радиотерапию, она умерла. Ей был 31 год.

Пока Генриетта лежала в госпитале Хопкинса, лечащий врач отправил полученные с помощью биопсии клетки опухоли на анализ Джорджу Гею — руководителю лаборатории исследования клеток тканей в госпитале Хопкинса. В то время культивирование клеток вне организма было только на стадии становления, и главной проблемой была неизбежная гибель клеток — после определенного количества делений вся клеточная линия погибала.

Оказалось, что клетки, обозначенные «HeLa» (акроним имени и фамилии Генриетты Лакс), размножались гораздо быстрее клеток из нормальных тканей.

Кроме того, злокачественная трансформация сделала эти клетки бессмертными — у них отключилась программа подавления роста после определенного количества делений.

In vitro такого прежде не происходило ни с какими другими клетками. Это открывало небывалые перспективы в биологии.

Действительно, никогда до этого момента исследователи не могли считать результаты, полученные на клеточных культурах, полностью достоверными: все опыты проводились на разнородных клеточных линиях, которые в конце концов погибали — иногда даже прежде, чем удавалось получить какие-нибудь результаты.

И тут ученые стали обладателями первой стабильной и даже вечной (!) клеточной линии, адекватно имитирующей свойства организма. А когда обнаружилось, что клетки HeLa способны пережить даже пересылку по почте, Гей разослал их своим коллегам по всей стране. Очень скоро спрос на клетки HeLa вырос, и их растиражировали в лабораториях по всему миру.

Они стали первой «шаблонной» клеточной линией.

Так получилось, что Генриетта умерла именно в тот день, когда Джордж Гей выступал перед телевизионными камерами, держа в руках пробирку с ее клетками. Он заявил, что началась эпоха новых перспектив в поиске лекарств и медико-биологических исследованиях.

Почему ее клетки так важны?

И он был прав. Линия клеток, идентичная во всех лабораториях мира, позволила быстро получать и независимо подтверждать всё новые и новые данные. Можно смело сказать, что гигантский прыжок молекулярной биологии в конце прошлого века был обусловлен возможностью культивировать клетки in vitro.

Клетки Генриетты Лакс стали первыми бессмертными человеческими клетками, которые когда-либо были выращены на искусственной питательной среде. HeLa научили исследователей культивировать сотни других линий раковых клеток.

И хотя в последние годы приоритет в этой области смещается в сторону культур клеток нормальных тканей и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (за открытие метода возвращения клеток взрослого организма в эмбриональное состояние японский ученый Синья Яманака получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2012 года), тем не менее раковые клетки остаются общепринятым стандартом в медико-биологических исследованиях. Основное преимущество HeLa — неудержимый рост на простых питательных средах, что позволяет проводить масштабные исследования при минимуме затрат.

С момента смерти Генриетты Лакс клетки ее опухоли непрерывно использовались для исследования молекулярных закономерностей развития самых разных заболеваний, в том числе рака и СПИДа, для изучения воздействия радиации и токсичных веществ, составления генетических карт и огромного количества других научных задач.

В мире биомедицины клетки HeLa стали столь же известны, как лабораторные крысы и чашки Петри. В декабре 1960 года клетки HeLa первыми полетели в космос в советском спутнике. Даже сегодня поражает размах экспериментов, проводившихся тогда советскими генетиками в космосе.

Результаты показали, что HeLa хорошо себя чувствуют не только в земных условиях, но и в невесомости.

Без клеток линии HeLa стала бы невозможной разработка вакцины против полиомиелита, созданной Джонасом Солком. Кстати, Солк был настолько уверен в безопасности полученной вакцины (ослабленного вируса полиомиелита), что в доказательство надежности своего лекарства вколол вакцину себе, своей жене и троим детям.

С тех пор HeLa использовали и для клонирования (предварительные опыты по пересадке клеточных ядер перед клонированием знаменитой овцы Долли проводились на HeLa), для отработки методов искусственного оплодотворения и тысяч других исследований (некоторые из них приведены в таблице).

Помимо науки..

Личность самой Генриетты Лакс долгое время не афишировалась. Для доктора Гея, конечно, происхождение клеток HeLa не было тайной, но он полагал, что конфиденциальность в этом вопросе является приоритетом, и в течение многих лет семья Лакс не знала, что клетки Генриетты прославились на весь мир. Тайна раскрылась только после смерти доктора Гея в 1970 году.

Напомним, что стандарты стерильности и техники работы с клеточными линиями в то время только зарождались, и некоторые ошибки всплывали лишь спустя годы.

Так и в случае с клетками HeLa — через 25 лет ученые выяснили, что множество используемых в исследованиях клеточных культур, происходящих из других типов тканей, включая клетки рака молочной и предстательной желез, оказались зараженными более агрессивными и живучими клетками HeLa.

Оказалось, что HeLa могут перемещаться с частицами пыли в воздухе или на недостаточно тщательно вымытых руках и приживаться в культурах других клеток. Это вызвало большой скандал.

В надежде решить проблему путем генотипирования (секвенирование — полное прочтение генома — в то время пока еще только планировалось как грандиозный международный проект), одна группа ученых разыскала родственников Генриетты и попросила образцы ДНК семьи, для того чтобы составить карту генов. Таким образом тайное и стало явным.

Кстати, американцы и сейчас переживают больше по поводу того, что семья Генриетты так и не получила компенсацию за использование клеток HeLa без согласия донора.

По сей день семья живет в не очень-то хорошем достатке, и материальная помощь была бы очень кстати.

Но все запросы упираются в глухую стену — ответчиков давно уж нет, а Медицинская академия и другие научные структуры предсказуемо не желают обсуждать эту тему.

11 марта 2013 года масла в огонь подлила новая публикация, где были представлены результаты полного сиквенса генома клеточной линии HeLa.

Опять же, эксперимент был проведен без согласия потомков Генриетты, и после непродолжительных этических споров полный доступ к геномной информации был разрешен только для профессионалов.

Тем не менее, полный геномный сиквенс HeLa имеет огромное значение для последующих работ, позволяя использовать клеточную линию в будущих геномных проектах.

Реальное бессмертие?

Злокачественная опухоль, убившая Генриетту, сделала ее клетки потенциально бессмертными.

Хотела ли эта женщина бессмертия? И получила ли она его? Если задуматься, возникает фантастическое ощущение — часть живого человека, искусственно размноженная, терпит миллионы испытаний, «пробует на вкус» все лекарства перед тем, как они попадут в испытания на животных, раздраконивается до самых что ни на есть основ молекулярными биологами во всем мире…

Конечно, всё это не имеет никакого отношения к «жизни после жизни». Глупо полагать, что в клетках HeLa, беспрестанно мучимых ненасытными учеными, существует хоть какая-то частичка души несчастной молодой женщины. Тем более что человеческими эти клетки можно считать лишь отчасти.

В ядре каждой клетки HeLa — от 76 до 82 хромосом из-за происшедшей в процессе озлокачествления трансформации (нормальные человеческие клетки содержат 46 хромосом), и эта полиплоидность периодически вызывает споры о пригодности клеток HeLa как модели человеческой физиологии.

Было даже предложено выделить эти клетки в отдельный, близкий человеку вид, под названием Helacyton gartleri, в честь Стенли Гартлера, исследовавшего эти клетки, однако всерьез это сегодня не обсуждается.

Тем не менее исследователи всегда помнят об ограничениях, которые необходимо иметь в виду.

Во-первых, HeLa, несмотря на все изменения, всё еще остаются человеческими клетками: все их гены и биологические молекулы соответствуют человеческим, а молекулярные взаимодействия в подавляющем большинстве случаев идентичны биохимическим путям здоровых клеток.

Во-вторых, полиплоидия делает эту линию более удобной для геномных исследований, так как количество генетического материала в одной клетке увеличено, и результаты получаются более четкими и контрастными.

В-третьих, широкое распространение клеточных линий по миру позволяет без проблем повторять опыты коллег и использовать опубликованные данные как фундамент для собственных исследований.

Установив основные факты на модели HeLa (а все помнят, что это хоть удобная, но только модель организма), ученые пытаются повторить их на более адекватных модельных системах. Как видно, HeLa и подобные им клетки представляют собой фундамент для всей науки и сегодня. И, несмотря на этические и моральные споры, сегодня хочется почтить память этой женщины, поскольку ее невольный вклад в медицину неоценим: клетки, оставшиеся после нее, спасли и продолжают спасать больше жизней, чем это может сделать любой врач.

Благодарим портал biomolecula.ru за помощь в подготовке статьи

См. также:
Ребекка Склут «Бессмертная жизнь Генриетты Лакс».

Источник: https://elementy.ru/nauchno-populyarnaya_biblioteka/432536/Bessmertnye_kletki_HeLa

Ваше здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: